摘要:采用柱前衍生反相液相色譜法分析棉籽粕中十八中氨基酸,衍生試劑為優(yōu)選的某試劑,流動相為醋酸鹽緩沖溶液、乙腈、水,二元梯度洗脫,色譜柱為AAK氨基酸柱,紫外檢測。該方法使用液相色譜儀,定性重復(fù)性好,定量準(zhǔn)確。
關(guān)鍵詞:液相色譜、氨基酸、棉籽粕
*,蛋白質(zhì)是飼料中zui主要的營養(yǎng)指標(biāo)之一,動物通過從飼料中攫取蛋白質(zhì),在其腸道中被分解成氨基酸而被機(jī)體吸收,從而合成自身的蛋白質(zhì),滿足機(jī)體自身的生長發(fā)育的需要,因此,飼料中充足的蛋白質(zhì)有利于動物機(jī)體充分發(fā)揮生長潛能。由于蛋白質(zhì)飼料營養(yǎng)價值zui為根本的決定因素是其氨基酸組成,因此近年來越來越多的企業(yè)注重對蛋白質(zhì)飼料氨基酸組成的分析,從氨基酸水平上評估蛋白質(zhì)飼料及配合飼料的品質(zhì)。
我國長江、黃河中下游和新疆地區(qū)為棉花主產(chǎn)區(qū),每年可提供約600萬噸棉籽,制油后棉籽餅粕總產(chǎn)量約300萬噸,故棉籽粕是我國重要的蛋白質(zhì)飼料資源。棉籽粕含有的粗蛋白可達(dá)40%以上。棉籽粕作為蛋白質(zhì)飼料的主要資源之一,除了要關(guān)注它的蛋白質(zhì)含量,對其氨基酸組成的分析也成為關(guān)注的焦點。
目前,飼料中氨基酸的測定主要是根據(jù)GB/T 18246-2000 《飼料中氨基酸的測定》方法來測定的,該方法是利用氨基酸分析儀來測定的,且對各種不同的氨基酸前處理方法不同,前處理方法比較復(fù)雜。
本文利用優(yōu)選的衍生試劑,通過柱前衍生,利用液相色譜來分析棉籽粕中的十八種氨基酸。
1 實驗部分
1.1 儀器及試劑
1.1.1 試劑及試劑的配制
1.1.1.1 乙腈(色譜純);
表一 十七種氨基酸標(biāo)樣中各氨基酸濃度
中文名稱 | 簡稱 | 分子量 | 濃度 (μmol/mL) | 濃度 (mg/100mL) |
天冬氨酸 | Asp | 133.1 | 2 | 26.62 |
谷氨酸 | Glu | 147.1 | 2 | 29.42 |
絲氨酸 | Ser | 105.1 | 2 | 21.02 |
精氨酸 | Arg | 174.2 | 2 | 34.84 |
甘氨酸 | Gly | 75.1 | 2 | 15.01 |
蘇氨酸 | Thr | 119.1 | 2 | 23.82 |
脯氨酸 | Pro | 115.1 | 4 | 46.05 |
丙氨酸 | | 89.1 | 2 | 17.82 |
纈氨酸 | Val | 117.1 | 2 | 23.44 |
蛋氨酸 | Met | 149.2 | 2 | 29.84 |
半胱氨酸 | Cys | 121.2 | 2 | 24.24 |
異亮氨酸 | Ile | 131.2 | 2 | 26.24 |
亮氨酸 | Leu | 131.2 | 2 | 26.24 |
苯丙氨酸 | Phe | 165.2 | 2 | 33.04 |
組氨酸 | His | 155.2 | 2 | 31.04 |
賴氨酸 | | 146.2 | 2 | 29.24 |
酪氨酸 | Tyr | 181.2 | 2 | 36.24 |
表二 飼料參比的百分含量
序號 | 中文名稱 | 簡稱 | 百分含量(%) |
1 | 天冬氨酸 | Asp | 1.56 |
2 | 谷氨酸 | Glu | 3.24 |
3 | 絲氨酸 | Ser | 0.94 |
4 | 精氨酸 | Arg | 1.25 |
5 | 甘氨酸 | Gly | 1.28 |
6 | 蘇氨酸 | Thr | 0.74 |
7 | 脯氨酸 | Pro | 1.40 |
8 | 丙氨酸 | | 1.18 |
9 | 纈氨酸 | Val | 0.92 |
10 | 蛋氨酸 | Met | 0.54 |
11 | 半胱氨酸 | Cys | 0.34 |
12 | 異亮氨酸 | Ile | 0.76 |
13 | 亮氨酸 | Leu | 1.68 |
14 | 苯丙氨酸 | Phe | 1.00 |
15 | 組氨酸 | His | 0.50 |
16 | 賴氨酸 | | 1.08 |
17 | 酪氨酸 | Tyr | 0.65 |
合計 | | | 19.06 |
液相色譜儀
大連依利特AAK氨基酸柱(
水解管:硬質(zhì)玻璃管,體積20~30mL
恒溫干燥箱、真空泵、漩渦混勻器、酒精噴燈等
1.2 儀器條件
檢 測 器:紫外可見檢測器;
檢測波長:360nm;
色 譜 柱: AAK氨基酸柱(
流 動 相:流動相A:乙腈:水=1:1;
流動相 B:0.05mol/L醋酸鈉溶液(稱取
流速:1.2mL/min;
柱溫:
進(jìn)樣量:20μL。
表三 梯度洗脫時間表
時間(min) | 0 | 0.3 | 4 | 9.5 | 17 | 20 | 28 | 34 | 37 | 38 |
流動相A | 16 | 16 | 31 | 36 | 55 | 55 | 65 | 100 | 100 | 16 |
流動相B | 84 | 84 | 69 | 64 | 45 | 45 | 35 | 0 | 0 | 84 |
1.3 樣品處理過程
噴燈封口,然后放入
2 結(jié)果與討論
2.1 專屬性
圖一 十七種氨基酸的色譜圖
十七種氨基酸的出峰順序:1、天冬氨酸;2、谷氨酸;3、絲氨酸;4、精氨酸;5、甘氨酸;6、蘇氨酸;7、脯氨酸;8、丙氨酸;9、纈氨酸;10、蛋氨酸;11、胱氨酸;12、異亮氨酸;13、亮氨酸;14、苯丙氨酸;15、組氨酸;16、賴氨酸;17、酪氨酸。
從圖一中可以看出,除了苯丙氨酸和組氨酸沒有分開之外,其余各峰均分離良好,苯丙氨酸和組氨酸可以用切分峰的方法進(jìn)行計算。
2.2 飼料參比的作用
由于酸水解過程中含硫氨基酸(半胱氨酸和蛋氨酸)部分被氧化而不能測準(zhǔn),所以要用飼料參比來加以校正。校正的方法是,通過用飼料參比中蛋氨酸和半胱氨酸的含量來校正標(biāo)樣中蛋氨酸和半胱氨酸的濃度含量,從而使得標(biāo)樣中蛋氨酸和半胱氨酸的含量準(zhǔn)確,再用標(biāo)樣去定量樣品中氨基酸含量。
2.3 色氨酸的檢測
色氨酸用提供的色譜條件就可以進(jìn)行檢測,可以得到分離良好的色譜圖,如圖二所示:
圖二 色氨酸色譜圖
2.4 棉籽粕樣品的分析結(jié)果
新疆棉籽粕的粗蛋白含量基本在42%~46%之間,此類棉籽粕的粗蛋白含量是很高的,很適合于做蛋白質(zhì)飼料,能夠測出此類棉籽粕的各種氨基酸的含量,尤其是必需氨基酸(賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸等)的含量,可以以此來評價棉粕的品質(zhì),并且可以為配合氨基酸成分平衡的飼料提供參考依據(jù)。表三 為新疆金鑫科技棉籽粕樣品的氨基酸分析結(jié)果。
表四 新疆金鑫科技棉籽粕樣品的氨基酸分析結(jié)果
中文名稱 | 簡稱 | 百分含量(%) |
天冬氨酸 | Asp | 3.75 |
谷氨酸 | Glu | 8.80 |
絲氨酸 | Ser | 1.43 |
精氨酸 | Arg | 4.04 |
甘氨酸 | Gly | 2.11 |
蘇氨酸 | Thr | 1.11 |
脯氨酸 | Pro | 1.73 |
丙氨酸 | | 1.66 |
纈氨酸 | Val | 2.02 |
蛋氨酸 | Met | 0.50 |
半胱氨酸 | Cys | 0.80 |
異亮氨酸 | Ile | 1.43 |
亮氨酸 | Leu | 2.46 |
苯丙氨酸 | Phe | 1.78 |
組氨酸 | His | 1.14 |
賴氨酸 | | 1.80 |
酪氨酸 | Tyr | 0.90 |
色氨酸 | Trp | 0.39 |
測定氨基酸總計 | | 37.85 |
粗蛋白 | | 44.61 |
3 結(jié)論
通過酸水解前處理的方法和飼料參比校正的數(shù)據(jù)處理可以同時檢測棉籽粕中十七種氨基酸,通過堿水解的方法可以檢測棉籽粕中的色氨酸。該衍生化方法簡便、產(chǎn)物穩(wěn)定,過量的衍生化試劑以及反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物對檢測沒有影響。二元高壓系統(tǒng)流量精度高,保留時間重復(fù)性好,紫外檢測器性能穩(wěn)定。該方法可廣泛應(yīng)用于飼料、食品、生化、醫(yī)藥等分析領(lǐng)域。
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